бесплатно рефераты скачать
  RSS    

Меню

Быстрый поиск

бесплатно рефераты скачать

бесплатно рефераты скачатьГальмування залізоініційованого окиснення фосфоліпідів

Гальмування залізоініційованого окиснення фосфоліпідів

55

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

ДОНЕЦЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ХІМІЧНИЙ ФАКУЛЬТЕТ

МАГІСТЕРСЬКА РОБОТА

на тему: Гальмування залізоініційованого окиснення фосфоліпідів

Магістр: Льовкіна Вікторія Вікторівна

Спеціальність: 8.07301 “Хімія”

Затверджено наказом №126/08 від 10 лютого 2004 р.

Керівник: к.х.н., професор кафедри

Ніколаєвський Алим Микитович

Донецьк-2004

До захисту магістрської роботи допустити протокол № 17

від “3 ”червня 2004 р.

Зав. кафедрою фізичної хімії, к.х.н., професор Ніколаєвський Алім Микитович

________________________

Магістрська робота захищена з оцінкою _________

“____” _____________ 2004 р.

Секретар ДЕК ___________________

________________________________

________________________________

Зміст

Вступ

1. Теоретична частина

1.1.Емульсія фосфоліпідів яєчного жовтка як модель пероксидного окиснення ліпідів

1.2.Механізм залізоініційованого окиснення вуглеводнів

1.3.Антиоксидантний захист біологічних об'єктів

1.3.1. Регуляторні системи пероксидного окиснення ліпідів

1.3.2. Особливості дії природних антиоксидантів

1.3.3.Гальмування процесів окиснення синтетичними інгібіторами фенольного типу

1.4.Методи дослідження біологічного окиснення

2. Експериментальна частина

2.1. Газоволюмометричний метод

2.2. Тонкошарова хроматографія

2.3 Техніка безпеки

3. Гальмування залізоініційованого окиснення фосфоліпідів

Висновки

Література

Вступ

У зв'язку із забруднюванням навколишнього середовища та ростом поширення різноманітних хвороб, розвиток яких прямо чи посередньо пов'язан з ушкоджуваною дією вільних радикалів, питання забеспеченості організма людини антиоксидантами стоїть достатньо гостро. Тому пошук нових ефективних біоантиоксидантів представляється дуже актуальною і важливою науковою і практичною проблемою особливо для України, що пов'язано з наслідками Чорнобильської аварії.

Найбільш вивченими інгібіторами радикально-ланцюгових процесів є фенольні сполуки. Однак, спроби перенести результати, отримані in vitro, на біологічні системи не завжди успішні, тому що складні міжфазні явища in vivo визначають поведінку антиоксидантів в окисному процесі. Тому сучасні дослідники для оцінки антиоксидантів використовують тестові системи, наближені до біологічних. Однієї з них є емульсія яєчного жовтка - біохімічна система, що містить мембранні структури клітин. Дані, отримані на цій моделі, мають велику достовірність з погляду застосування до біологічних процесів, тим більше, що окиснення проводять в умовах, близьких до фізіологічних.

У зв'язку з цим метою даної роботи стало вивчення закономірностей інгібуючої дії фенольних антиоксидантів в процесі залізоініційованого окиснення жовточних ліпопротеїнів для пошуку нових ефективних антиоксидантів.

Теоретична частина

1.1. Емульсія фосфоліпідів яєчного жовтка як модель пероксидного окиснення ліпідів

В даний час загальновизнаною є роль пероксидного окиснення ліпідів в біологічних організмах [1]. В нормальному функціонуванні живих клітин першорядне значення мають біологічні мембрани, динамічними компонентами яких, що забезпечують стабільність біомембраної організації, є фосфоліпіди. В тканинах організмів утворення пероксидів і їхня витрата знаходяться на постійному стаціонарному рівні. Порушення цієї рівноваги в будь-який бік призводить до виникнення різних патологій.

Щоб дослідити можливість регулювання пероксидного окиснення ліпідів, що протікає за вільнорадикальним механізмом [2], для пошуку ефективних антиоксидантів цього процесу велике значення мають експерименти по моделюванню природних структур клітини.

Існують різні моделі пероксидного окиснення ліпідів.

I. Природні системи:

плазма людської крові [3,4],

гомогенати органів [2].

Дані моделі дуже нестабільні і легко окиснюються.

II. Синтетичні моделі пероксидного окиснення ліпідів у різних хемілюмінесцентних системах:

- модель, яка складається з пероксида водню і пероксидази з кореня хрону [5],

люмінол з додаванням ініціаторів [6],

лінолева кислота [7],

які далекі від живої системи.

Класичною моделлю клітинних мембран живих організмів є емульсія ліпопротеїдів яєчного жовтка [8,9], що дозволяє адекватно оцінювати антирадикальну активність досліджуваних сполук за ефектом гальмування пероксидного окиснення. Ця система відрізняється своєю доступністю, великою стабільністю при збереженні, дозволяє використовувати звичайні лабораторні методики й апаратуру для визначення рівня пероксидації ліпідів [10].

В медицині і біології широко використовується емульсія яєчного жовтка в фосфатному буфері. Сам жовток [11] на ~50% складається з води, 16% - білка, 34% - жирів, тому він являє собою емульсію, де жир у водній фазі є головною складовою частиною.

У жовтку яєць зосереджені практично всі ліпіди: прості ліпіди і жири, вміст яких складає біля 2/3 всіх ліпідів, і складні ліпіди (жироподібні сполуки), в основному фосфоліпіди - 37%, з них 82% - фосфатидилхолін, 15% - фосфатидилетаноламін. Більш 60% жирних кислот, що входять до складу ліпідів яйця, є ненасиченими, які в свою чергу беруть участь у пероксидному окисненні.

Як природна система емульсія містить вітаміни, ферменти, багато хто з них є ендогенними антиоксидантами.

Біологічні мембрани являють собою напівпроникний бар'єр, що відокремлює клітину від навколишнього середовища і дозволяє їй існувати як єдине ціле. Незважаючи на різноманітність біологічних функцій, форм і розмірів всі мембрани побудовані в основному з 2-х типів речовин: ліпідів і білків. Мембранні ліпіди - низькомолекулярні речовини, які відносяться до жирів. Характерна риса будь-якої ліпідної молекули полягає в тому, що вона побудована з двох частин: (полярної) голівки, яка несе електричні заряди і на яку приходиться не більш чверті довжини всієї молекули, і довгих хвостів, що не несуть електричного заряду [12]. Хвости ліпідної молекули - довгі ланцюги, побудовані з атомів С и Н. Голівки можуть мати різноманітну будову, але для ліпідів мембран найбільш характерні два типи: похідні цукрів - гліколіпіди чи похідні фосфорної кислоти - фосфоліпіди.

Рис.1.1. Схема будови молекул фосфоліпідів.

Варто помітити, що полярні голівки всіх ліпідних молекул або заряджені негативно, або нейтральні (несуть одночасно і негативні, і позитивні заряди). В ліпідних молекулах ланкою, яка зв'язує хвіст і голівку, найчастіше служить залишок гліцерину; такі сполуки носять загальну назву - гліцероліпіди.

На схемі будови у ліпідів зображено два неполярних хвости. Ця характерна риса більшості ліпідних молекул, що входять до складу мембран.Одноланцюгові ліпіди звичайно не синтезуються клітинами в значній кількості, тому що вони руйнують мембрани [13].

Ліпіди, що входять до складу біомембран, можна підрозділяти на полярні ліпіди (фосфо-, гліко- і сфінголіпіди) і нейтральні (стерини).

В молекулах фосфоліпідів залишок фосфорної кислоти з'єднаний із гліцерином, ацільованим двома залишками жирних кислот. В природних фосфоліпідах в положенні 1 знаходиться, як правило, залишок насиченої жирної кислоти (найчастіше пальмітинової чи стеаринової), а в положенні 2 - залишок ненасиченої кислоти (олеїнової, лінолевої, арахідонової і декозагексаєнової) [13].

Основними компонентами мембран є фосфатидилхолін (ФХ), фосфатидилетаноламін (ФЕА), холестерин і різні гліколіпіди:

Фосфатидилхолін (лецитин)

Фосфатидилетаноламін (кефалін)

Наявність в молекулах ліпідів двох частин має пряме відношення до їх здатності утворювати мембрани. Ліпіди дуже погано розчиняються як в полярному розчиннику - воді (заважають неполярні хвости), так і в неполярному середовищі - олії (заважають полярні голівки). Щоб підкреслити різне відношення до води й олії, голівки називають гідрофільними, а хвости - ліпофільними. Відповідно ліпіди, молекули яких містять як гідрофільне, так і ліпофільне угрупування, називають амфіфільними речовинами.

Внаслідок поганої розчинності у воді і схильності до агрегації фосфоліпіди в водній фазі вже при низьких концентраціях (10-7-10-9М) здатні самоорганізовуватися або в структури типу протяжних подвійних шарів, що відділені один від одного водною фазою, або в замкнуті бульбашки - ліпосоми.

Ліпосоми (везикули) є найближчим аналогом біомембран. Вони являють собою замкнуті сферичні структури , що містять всередині воду в вигляді бульбашки і мають один чи кілька подвійних шарів ліпідів [14].

Рис.1.2. Ліпід-білковий подвійний шар - рідинно-мозаїчна модель.

Везикули можуть бути отримані із синтетичних амфіфілів і екстрактів мембран. Реконструйовані мембрани, тобто ліпосоми з мембранних складових клітин, містять майже всі компоненти клітинної мембрани: ліпіди, білки, гліколіпіди тощо.

Фосфоліпіди орієнтовані в подвійному шарі таким чином, щоб звести до мінімуму взаємодію між аполярними частинами їхніх молекул з водною фазою. Тому в подвійному шарі залишки жирних кислот контактують один з одним і формують гідрофобну зону, що відділена від водної фази зарядженим шаром, що складається з полярних “голівок”. Асоціація ліпідів в структури, обумовлена гідрофобними взаємодіями, супроводжується зменшенням вільної енергії, в результаті чого ці структури є стабільними. Ліпідний подвійний шар володіє одночасно і текучістю, і упорядкованістю структури, в зв'язку з чим у мембрані здійснюються взаємодії не тільки ближнього, але і далекого порядку. Така сукупність властивостей характерна для рідиннокристалічного стану, існування якого є необхідною умовою життєдіяльності біологічних систем.

Рухливість компонентів ліпідного подвійного шару забезпечується як визначеними властивостями молекул фосфоліпідів взагалі, так і властивостями окремих груп в кожній молекулі. Молекула фосфоліпідів в подвійному шарі може робити рухи трьох типів: обертання навколо власної осі, переміщення в площині подвійного шару (латеральна дифузія) і переміщення з одного шару в іншій (фліп-флоп) [13].

Простий фосфоліпідний подвійний шар має товщину ~37A, що може збільшуватися до 45-50A, якщо подвійний шар зв'язує холестерин і білок [12].

Основними компонентами біомембран, крім ліпідів, є білки. Білки біомембран в залежності від їхнього розташування можна розділити на дві великі групи: периферичні білки, що розташовуються на поверхні мембран, і інтегральні білки, що або глибоко занурені в гідрофобну область мембрани, або пронизують її наскрізь. Крім білків і ліпідів, в мембранах містяться протеоліпіди, тобто білки, ковалентно зв'язані з залишками ліпіду, чим вони і відрізняються від ліпопротеїнів, в яких комплекси між білком і ліпідом утворюються за рахунок нековалентних зв'язків [10].

Периферичні білки легко екстрагуються з мембрани слабкими розчинами солей і добре розчинюються у воді, вони зв'язані з поверхнею мембрани в основному електростатичними силами. Нерозчинні у воді інтегральні білки виділяють за допомогою детергентів чи органічних розчинників. Основний тип зв'язку між інтегральними білками і ліпідами мембран - це гідрофобні взаємодії. Існують також білки, що обмінюють ліпіди, які здатні здійснювати перенос фосфоліпідів між мембранами [15].

При зв'язуванні з фосфоліпідною мембраною периферичних білків відбувається зміна в їхній структурі. Можливо, часткове проникнення білків в товщу одинарного шару викликає його разупорядкування, що сприяє більш високої проникності іонів [16].

Таким чином, ліпопротеїни - це високомолекулярні водорозчинні частинки, що представляють собою комплекс білків (аполіпопротеїнів) і ліпідів, утворений нековалентними зв'язками, в яких полярні групи ліпідів разом з білком формують поверхневий гідрофільний шар, що оточує і захищає внутрішню гідрофобну ліпідну сферу від водного середовища.

1.2. Механізм залізоініційованого окиснення ліпідів

Окиснення біологічних мембран, основними компонентами яких є фосфоліпіди, що містять у своєму складі залишки ненасичених жирних кислот (НЖК), являє собою складний багатостадійний процес.

Як було раніше [2] доведено, це дійсно ланцюговий процес, який характеризується всіма рисами вільнорадикальної ланцюгової реакції: для його початку необхідна поява в системі вільних радикалів (ініціювання ланцюга), його протікання підкоряється кінетиці ланцюгових реакцій, між реакцією ініціювання споживання кисню і нагромадження гідропероксиду немає простих стехіометричних співвідношень, продукти реакції мають велику складність і інгібітори вільнорадикальних реакцій гальмують процес утворення пероксидів in vitro.

Друга найважливіша особливість процесу пероксидного окиснення ліпідів - це практично абсолютна необхідність іонів негемінового двовалентного заліза для його протікання при фізіологічних температурах. У цьому відношенні ліпідні системи відрізняються від моделей пероксидного окиснення ненасичених жирних кислот, наприклад лінолевої [2], у якій ефективні іони багатьох металів перемінної валентності. Є два шляхи пероксидного окиснення ліпідів біомембран, що принципово розрізняються на стадії ініціювання [17]. У першому випадку іони заліза - центри радикалоутворення - відновлюються ланцюгом переносу електронів ферментативно - НАДФН - специфічна система (НЗП). У неферментній системі (АЗП) відновлення заліза відбувається під дією аскорбінової кислоти й інших відновників з підходящим редокс-потенціалом. Реакції протікають за наступною схемою [1,18,19]:

Прооксидантна дія заліза опосередкована, тобто в цих реакціях залізо бере участь не у вільному, а в зв'язаному виді. З'єднуючись з визначеними функціональними групами білків, іони заліза стають пунктами радикалоутворення - центрами реакції ініціювання. У випадку НЗП ведучу роль у цьому процесі можуть грати сульфгідрильні групи цитохрома Р-450, що входять до складу його активного центра, також ініціює пероксидне окиснення комплекс АДФ-Fе2+. В АЗП на роль таких можуть претендувати функціональні групи мембранних білків, локалізовані в гідрофобній частині мембран.

Кінетика і стехіометрія обох процесів підтверджують представлення, відповідно до якого в основі розвитку цих реакцій лежить єдиний механізм - ланцюговий радикальний процес. Основні реакції, зв'язані з пероксидним окисненням ліпідів (ПОЛ) у біологічних мембранах, наступні [2,17]:

Ініціювання ланцюга:

Продовження ланцюга:

Розгалуження ланцюга:

Обрив ланцюга:

Таким чином, пероксидне окиснення ліпідів являє собою типовий ланцюговий процес з виродженим розгалуженням. У живій клітці матеріальним механізмом процесу біологічного окиснення є дихальний ланцюг - система транспорту електронів від відновленого органічного субстрату до кисню. Компоненти дихального ланцюга (близько 40) локалізовані у внутрішній мембрані мітохондрій. Спеціалізовані білки (залізо-сірчані, гемовмісні), у яких іони металів з перемінною валентністю, убіхінони, флавіни виконують роль переносників електронів:

Активні форми кисню ( ), що виникли в ході цього процесу в силу можливого “витоку” із системи транспорту електронів можуть ініціювати неферментативне пероксидне окиснення ліпідів [1]. Вирішальну роль в його регуляції в мембранах грають іони заліза [20]. Реагуючи з гідропероксидами, двовалентне залізо різко прискорює процес ланцюгового окиснення ліпідів, розгалужуючи ланцюг. Але, взаємодіючи з вільними радикалами, що ведуть ланцюг, те ж саме двовалентне залізо інгібує реакції ланцюгового окиснення, діючи як антиоксидант.

Що ж визначає співвідношення між цими двома реакціями заліза? Наявні дані говорять про те, що воно визначається співвідношенням концентрації гідропероксиду і заліза в системі. Очевидно, двовалентне залізо набагато швидше реагує з гідропероксидами, чим з вільними радикалами. Спочатку залізо розкладає всі гідропероксиди, а вже потім, якщо воно в надлишку, вступає в реакцію з радикалами.

При окисненні ліпідної фази біомембран велике значення має місце взаємодії гідропероксидів ліпідів з іонами двовалентного заліза і доля вільних радикалів, що утворюються в цій реакції [21]. Деталі даного процесу не вивчені. Припускають, що проникнення іонів Fe2+ (де, зважаючи на все, йде ланцюгова реакція окиснення НЖК фосфоліпідів) малоймовірно. Скоріше відбувається “виринання” гідропероксидної групи на поверхню ліпідного шару і зворотне занурення вільного радикала, що утворився в реакції з залізом, в товщу ліпідної фази.

Було встановлено [17], що склад ліпідів і швидкість їхніх окисних перетворень взаємозалежні. Зміна складу ліпідів мембран спричиняє зміну мікров'язкості ліпідного компонента, ліпід-білкових взаємодій і умов для структурних переходів у мембранах. Збільшення антиоксидантної можливості призводить до переходу ліпідів мембран у більш “рідкий” стан, у той час як зниження антиоксидантної активності робить ліпідну фазу більш в'язкою. Жирнокислотні ланцюги з гідрофільними кисневмісними угрупуваннями, що проникли в них, будуть виштовхуватися з гідрофобного оточення і наближатися або входити в контакт із зовнішньою водною фазою. Це призводить до розпушення мембрани, до появи в них гідрофільних “пір” [22]. Ці процеси прискорюють подальше пероксидне окиснення фосфоліпідів у біомембранах.

1.3. Антиоксидантний захист біологічних об'єктів

1.3.1 Регуляторні системи пероксидного окиснення ліпідів

Біологічна значимість того або іншого процесу в живих клітках стає загальновизнаною звичайно після того, як виявляються спеціальні ферментативні системи, що регулюють даний процес.

У клітці існує кілька систем [17], що змінюють швидкість окиснення ліпідів і які можна розглянути як регуляторні. Ці системи можна розбити на чотири групи. Система I, відповідальна за строго визначену структурну організацію ліпідів і яка впливає таким чином на швидкість реакції ініціювання, продовження й обриву ланцюга. Ця система відповідає за доступність залишків НЖК фосфоліпідів мембран до дії кисню, чим щільніше упаковка НЖК в фосфоліпідах мембран, тим менше до них доступ кисню, тим нижче швидкість зародження вільних радикалів. Будь-які агенти, що порушують упаковку НЖК, прискорюють окиснення ліпідів. Фактори, що підтримують структуру ліпідів мембран, гальмують окиснення. При моделюванні ПОЛ у мембранах in vitro порушується структурованість ліпідного подвійного шару. Тому кількісні характеристики, отримані на таких модельних системах, можуть бути з визначеною обережністю перенесені на окиснення ліпідів in vivo, структурованість яких впливає на швидкість їхнього окиснення (структурне інгібування).

Страницы: 1, 2, 3, 4


Новости

Быстрый поиск

Группа вКонтакте: новости

Пока нет

Новости в Twitter и Facebook

  бесплатно рефераты скачать              бесплатно рефераты скачать

Новости

бесплатно рефераты скачать

© 2010.